原代細胞獲取培養(yǎng)方法及可試用實驗類型
發(fā)布時間：2023-05-30 瀏覽次數(shù)：2698
說到細胞，我想大家應該都不陌生。我們最初了解細胞這個名詞應該是在初中高中的生物課本上。大家知道，我們的生命體都是由細胞這個微小的單位組成（病毒除外）。那么我們今天就來聊聊什么是原代細胞。
原代細胞(primary cell)：是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養(yǎng)的細胞，稱為原代細胞。一般認為，培養(yǎng)的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。
在我們的科學研究過程中，每個涉及到細胞研究的研究者都會根據(jù)自己的實驗需求采用不同的細胞。根據(jù)自己的課題采用原代細胞或者細胞系，細胞系的培養(yǎng)相對于原代細胞來說更為的簡單和易操作，也不會擔心細胞在正常條件下會發(fā)生分化、衰老等現(xiàn)象從而影響我們實驗的可信性和重復性。而原代細胞從獲取到培養(yǎng)整個過程要考慮的問題則非常多，接下來我們就具體聊聊吧。
一、原代細胞的獲取
原代細胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個細胞再進行培養(yǎng)的過程，且整個過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有：組織分解的方式，培養(yǎng)的時間，換液時間，細胞狀態(tài)判斷和凍存。
1.組織分解方式
將組織分解成單個細胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對貼壁細胞）。
【a】酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。
膠原酶的選擇：（根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實驗成功的大前提。）
膠原酶的配制：建議看相關的文獻進行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。
胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細胞中會加入胰酶，相關文章也蠻多的）
膠原酶消化時間：根據(jù)組織特性，消化時間會有差異。以小鼠腎細胞為例，加入膠原酶Ⅰ進行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細小，時間可以短一些，30min左右即可）。
培養(yǎng)過程：注意原代細胞在培養(yǎng)2天后可能會出現(xiàn)細胞液變黃（橘黃色）的現(xiàn)象，且無漂浮物，這是正?，F(xiàn)象哦，不是污染。這是由于細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變，所以變黃。
【b】組織塊法
取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm2），清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。
加液：培養(yǎng)液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液。
2.培養(yǎng)時間
無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養(yǎng)時間最少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。
3.換液時間
無論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時關注細胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。
4.細胞狀態(tài)判斷
正常貼壁細胞在培養(yǎng)幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細胞圖（左：小鼠成纖維細胞；右：人成纖維細胞）
這些細胞的狀態(tài)比較好，生長至80%~90%融合就可以傳代啦，傳代一次后的細胞會更干凈漂亮。
5.凍存
傳一代后的細胞（也可以不傳代直接凍存）培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實驗用。
凍存液配制：不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案，各實驗室也有自己的凍存方案，常見的方案有：
a: 10%DMSO+90%的FBS
b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM
c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS
二、原代細胞的培養(yǎng)
原代細胞的培養(yǎng)其實與細胞系的培養(yǎng)無多大差別，針對不同的細胞會選擇不同的細胞培養(yǎng)液。
1.培養(yǎng)液選擇：（根據(jù)不同的細胞類型和實驗要求進行培養(yǎng)液的選擇）
最常用的L/H DMEM，F(xiàn)12 DMEM，RPMI 1640。
2.細胞培養(yǎng)過程無菌操作。正常的復蘇，換液和傳代操作，最后將培養(yǎng)好的細胞進行相應的實驗即可
3.細胞鑒定。有時候我們獲取的原代細胞可能會有不是自己期望的細胞在里面，或者獲取的不是我們的目標細胞。這個時候我們需要進行細胞的鑒定。細胞鑒定需要購買特定細胞的表面標志物抗體或者染色試劑進行鑒定。如：
上圖：為鹿茸間充質(zhì)層細胞，它可以被甲苯胺藍染色藍色，胞質(zhì)胞核均被染成藍色。下圖：為鹿茸軟骨層細胞，被甲苯胺藍染色后胞質(zhì)胞核均染成紫紅色，因其內(nèi)部富含蛋白多糖，可被異染成紫紅色。
三、原代細胞試用的實驗類型
前面我們了解了原代細胞獲取和培養(yǎng)過程中應該注意的一些細節(jié)，這有助于我們培養(yǎng)我們的原代細胞。那么原代細胞培養(yǎng)好后，它可適用哪些研究呢？
原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎研究，如蛋白質(zhì)組學、基因組學、細胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學研究等，還可應用于當今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。在這些應用中幾乎都涉及了幾個最常見的且最基礎的細胞實驗，如下：
1.細胞增殖檢測：
常見檢測方法：CCK8檢測法 ，MTT檢測法，Brdu檢測法，Edu檢測法，平板克隆形成
2.細胞周期檢測
常見檢測方法：流式檢測細胞周期，標記有絲分裂百分率法
3.細胞凋亡檢測
常見檢測方法：流式檢測細胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測，Hoechst染色，電鏡，TUNEL
4.細胞轉(zhuǎn)移能力檢測
常見檢測方法：細胞劃痕實驗，Transwell實驗，Invasion實驗
以上就是原代細胞獲取和培養(yǎng)過程中的注意事項，不知道有沒有幫到大家呢？歡迎一起探討哦~
來源：“ 酶聯(lián)生物mlbio”公眾號
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