產(chǎn)品名稱：腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)
英文名稱：Multiplex PCR Detection Kit for Diarrheogenic Escherichia coli(Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 規(guī)格 |
| FZ022BF2 | 48 測(cè)試/盒 |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本試劑盒僅適用于食品中產(chǎn)志賀毒素（STEC）/腸道出血性（EHEC）、腸道致病性（EPEC）、腸道集聚性（EAEC）、腸道侵襲性（EIEC）、產(chǎn)腸毒素（ETEC）大腸埃希氏菌的毒力基因和類型判別的定性檢測(cè)。
檢測(cè)原理：基 于 Real Time PCR 技 術(shù) ， 利 用 針 對(duì)《GB4789.6-2016》中的 12 個(gè)毒力基因設(shè)計(jì)的引物、熒光探針以及其他反應(yīng)優(yōu)化配置所需試劑組合成 A、B、C 三管體系，同時(shí)往三管體系加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被 Taq 酶分解并產(chǎn)生熒光信號(hào)，此時(shí)熒光定量PCR 儀可識(shí)別該熒光信號(hào)，同時(shí)根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定大腸埃希氏菌的致瀉類型。
A 管體系可用于 STEC/EHEC、EPEC 檢測(cè)，B 管體系可用于 EAEC 檢測(cè)和大腸埃希氏菌種屬鑒定，C 管體系可用于 ETEC、EIEC 檢測(cè)。
腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)產(chǎn)品組分：
儲(chǔ)存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲(chǔ)存，有效期為 12 個(gè)月，避免反復(fù)凍融。冷凍條件下運(yùn)輸。
靈敏度：單通道最低檢驗(yàn)限達(dá)到 100~500 cfu/Test。
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測(cè) FAM、VIC、Cy5、ROX 標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南：
1，樣品前處理：參照 GB 4789.6?2016，使用 1 μL 接種環(huán)刮取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板或斜面上培養(yǎng) 18 h~24 h 的待鑒定的可疑菌落，懸浮到含 30 μL 裂解液或者無(wú)菌水的 0.2 mL 無(wú)菌離心管中，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min；12000 r/min 離心 15 min，上清即為粗提的 DNA，可轉(zhuǎn)移至 0.2 mL 無(wú)菌離心管中，在-20℃下可長(zhǎng)期保存。也可以選擇商業(yè)化的細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提??；
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取 n 個(gè) PCR 反應(yīng)管（n=1 管陰性對(duì)照+待檢測(cè)樣品數(shù)+1 管陽(yáng)性對(duì)照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入 20 μL 預(yù)混液，待用。
2) 向上述 n 個(gè)反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、待測(cè)樣品 DNA、陽(yáng)性對(duì)照各 5 μL，總反應(yīng)體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 檢測(cè)通道，在反應(yīng)階段 2 中 59℃時(shí)收集熒光信號(hào)，具體程序如下：
| 反應(yīng)階段 | 溫度 | 時(shí)間 | 信號(hào)收集 | 循環(huán)數(shù) |
| 1 | 95°C | 1 min | 1 | |
| 2 | 95°C | 10 sec | } 40 | |
| 59°C | 40 sec | ? |
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動(dòng)設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測(cè)結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對(duì)照未出現(xiàn)明顯的 S 型擴(kuò)增曲線或Ct 值＞37，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn) S 型擴(kuò)增曲線且其 Ct 值＜25。若陰陽(yáng)性對(duì)照不同時(shí)滿足上述條件，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
| Ct值 | 每個(gè)基因判讀結(jié)果 |
| ≤30 | 對(duì)應(yīng)的基因陽(yáng)性。 |
| 30~37 | 建議重新檢測(cè)，若復(fù)測(cè)結(jié)果 Ct≥37，則對(duì)應(yīng)的基因陰性；若重做結(jié)果 Ct＜37，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性。 |
| ≥37 | 對(duì)應(yīng)的基因陰性。 |
各致病型陽(yáng)性判別標(biāo)準(zhǔn)：
? astA 和 pic 基因可在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，當(dāng)與其他 DEC 毒力基因檢測(cè)結(jié)果同時(shí)陽(yáng)性時(shí)，則 astA 和 pic 基因不作為型別判定依據(jù)。
? stp 基因靈敏度稍低，為保證檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)樣品的 DNA 濃度高一點(diǎn)為好。
? 一般豬源的 ST 基因和人源的 ST 基因在分離的菌株中只存在其中一種，特殊情況下除外。
? 多重 qPCR 檢測(cè)可能出現(xiàn)不同熒光通道之間競(jìng)爭(zhēng)抑制的問題，單基因分析時(shí)適當(dāng)調(diào)整閾值線。
