國際主流大腸菌群計數(shù)標準關(guān)鍵環(huán)節(jié)差異化分析
發(fā)布時間：2024-02-28 瀏覽次數(shù)：870
來源：“六扇門Study”公眾號，作者~SIXDoors
去年，小六對比了GB4789.3 -2016版、GB4789.3征求意見版、ISO方法、美國FDA/BAM方法在不同操作環(huán)節(jié)的差異，現(xiàn)跟小伙伴們一起復習一下！
不同標準主要差異匯總及分析
大腸菌群計數(shù)有兩種方法：MPN法和平板計數(shù)法。一般情況，MPN法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數(shù)。平板計數(shù)法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數(shù)。
MPN法各標準差異不大，主要體現(xiàn)在前處理和培養(yǎng)溫度上，小伙伴們可查閱上圖，小六接下來主要針對“平板計數(shù)法”各環(huán)節(jié)進行比較分析哈。
1、樣品前處理環(huán)節(jié)
采樣量上，GB為25g+225mL，BAM法為50g+450mL，ISO方法有專門的樣品前處理指南，不同類型的樣本采樣量和處理方法都不同，多數(shù)為25g+225mL。
小六觀點，
采樣量大必然會提高檢出率，對產(chǎn)品控制更嚴格，但同時也需要結(jié)合國家食品安全整體管理思路和實際可操作性綜合考慮。
2、接種環(huán)節(jié)
新版GB4789.3征求意見稿中：傾注15mL~20mL，為防止菌落蔓延，待瓊脂凝固后，可再均勻覆蓋 3 mL～4 mL VRBA 到整個平板表面。
小六觀點，
相比2016版本，“勻覆”不是必要操作，使用者可根據(jù)實驗室樣品的情況來選擇，更為靈活，可提高效率并降低成本。
并要求從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min。
BAM標準的操作為：10mL（先倒）+5mL（覆蓋，防止細菌蔓延）；如果細胞受損需要修復，取8-10mL冷卻48℃的胰蛋白胨大豆瓊脂將樣品液與其混合，室溫放置2±0.5h，再加入8-10mL冷卻至48℃的VRBA覆蓋。
ISO4832-2006標準為：15mL（先倒）+4mL（覆蓋，防止細菌蔓延），并要求傾注時間控制在15min內(nèi)完成。
小六觀點，
BAM標準充分考慮了加工過程樣本中受損嚴重菌的修復，標準考慮到了從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min，主要是考慮到腸桿菌科類細菌繁殖周期20分鐘。
3、培養(yǎng)條件
新版GB4789.3征求意見稿中增加了乳制品的培養(yǎng)溫度為“30 ℃ ±1 ℃培養(yǎng) 18 h～24 h”，其中BAM標準為32℃，ISO標準為30 °C。
其中ISO標準平板計數(shù)法和MPN法乳制品的培養(yǎng)溫度都要求為“30 °C”。
國內(nèi)外文獻報道，培養(yǎng)溫度為 30 ℃時乳制品中大腸菌群平板計數(shù)的結(jié)果，顯著高于培養(yǎng)溫度為 36 ℃的計數(shù)結(jié)果。本次國標修訂，起草組經(jīng)調(diào)查研究和實驗驗證，試驗驗證發(fā)現(xiàn)，對于自然污染大腸菌群的生乳，無論是使用VRBA平板計數(shù)還是測試片計數(shù)，培養(yǎng)溫度為30 ℃的計數(shù)結(jié)果均高于36 ℃。經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，差異都有極顯著性意義。
小六比較好奇，
是乳制品基質(zhì)中有特定的“優(yōu)勢菌群”跟其他食品不同？這部分菌的最適生長溫度是30 ℃？
還是生乳經(jīng)過生產(chǎn)加工過程，菌受損且生產(chǎn)環(huán)境溫度低，培養(yǎng)溫度過高，不利于菌株的復蘇和生長？
歡迎小伙伴們發(fā)言討論！
4、確證實驗
新版GB4789.3征求意見稿中要求“從同一稀釋度的 VRBA平板上挑取典型和可疑菌落各 5 個，少于 10 個者，則挑取其全部菌落。”并給出了可疑菌落和典型菌落的描述。同時增加了附錄D，結(jié)果計算示例，方便使用者參考。
2016版本是挑取10個不同類型的典型和可疑菌落；BAM標準是挑取10個典型菌落；ISO標準是至少挑取5個典型菌落。
小六觀點，
本次國標修訂在這一點上立足標準實際應用者的視角，對如何挑菌驗證有詳細規(guī)定，對典型和非典型菌落要分開驗證，并且給出了菌落形態(tài)的具體描述，方便一線操作者對照，可以大大提高檢驗的質(zhì)量和效率。
5、增加了“測試片”法
新版GB4789.3征求意見稿中提到“8.2.3 若采用大腸菌群計數(shù)測試片，則按其說明進行操作”。這是繼GB4789.2后又一標準增加了“測試片”！
小六觀點，
小六看編制說明，修訂組是在參考大量的國際標準并進行了充分的實驗室內(nèi)和實驗室間驗證后，增加了測試片的并行準入。
同時，測試片是商品化即用型的培養(yǎng)基系統(tǒng)，無需進行培養(yǎng)基制備，配方標準化，操作簡單，不需進行復發(fā)酵實驗且判讀直觀方便，一般培養(yǎng)18-24h即可出結(jié)果，大大提高了實驗人員的工作效率。小六覺得測試片的這些特點是修訂組考慮將其納標準的主要因素，立足標準使用者的實際需求，提供方便簡化操作的可選方案。
標準修訂者在某次大會上也介紹了標準對測試片性能的要求：
標準中對大腸菌群計數(shù)測試片規(guī)定了性能要求：應以發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣為陽性結(jié)果判斷為依據(jù)，也就是測試片上必須是有氣泡哦。同時其性能要符合GB4789.28中相關(guān)培養(yǎng)基的質(zhì)量要求。
以上僅代表小六的分析哈，歡迎小伙伴們補充觀點！
