GB5749-2022 規(guī)定的常規(guī)檢驗微生物指標(biāo)共3項，總大腸菌群、大腸埃希氏菌、菌落總數(shù)。

其中水中菌落總數(shù)可作為評價水質(zhì)清潔程度和考核凈化效果；大腸菌群指示水體是否存在腸道傳染病的可能性。
總大腸菌群主要包括4個菌屬：埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，有的也可以在營養(yǎng)豐富的水體中檢出，即在非糞便污染的情況下，也有檢出這些細(xì)菌的可能性。耐熱大腸菌群和總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個種，即大腸埃希氏菌。檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數(shù)量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義最大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的衛(wèi)生學(xué)意義稍遜一些。

 PART.1 檢測依據(jù)  

1、GB/T 5750.2-2023《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 第2部分：水樣的采集與保存》
2、GB/T 5750.12-2023《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 第12部分：微生物指標(biāo)》 

  PART.2 水樣采集  

一、采樣容器：潔凈磨口硬質(zhì)玻璃瓶；潔凈聚乙烯瓶（桶或袋）；也可以使用符合要求的一次性采樣袋或采樣瓶。

二、采樣容器的洗滌

1. 容器洗滌：將容器用自來水和洗滌劑洗滌，并用自來水徹底沖洗后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸（或鹽酸）浸泡8h以上，然后依次用自來水和純水洗凈。
2. 容器滅菌：可采用干熱或高壓蒸汽滅菌兩種。干熱滅菌要求160℃下維持2h；高壓蒸汽滅菌要求121℃下維持15min，高壓蒸汽滅菌后的容器如不立即使用，應(yīng)置于60℃烘箱內(nèi)將瓶內(nèi)冷凝水烘干。滅菌后的容器應(yīng)在2周內(nèi)使用。

三、采樣要求

1. 無菌操作。
2. 不應(yīng)用水樣蕩洗已滅菌的采樣瓶或采樣袋 。
3. 避免手指和其他物品對瓶口或袋口的玷污。
4. 自來水水樣：先將水龍頭用火焰燒灼3min滅菌再開放水龍頭使水流5min（經(jīng)常用水的水龍頭放水1-3min）后，采集水樣。
5. 水源水水樣：選有代表性的地點及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采樣后在水中蓋好蓋子，再從水中取出。
6. 從速送檢，在0~4℃下保存，水樣從采集到檢驗不應(yīng)超過8h。

 PART.3.2 項目測定：總大腸菌群 

一、概念

1. 一群在37℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括埃希氏菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬。
2. 飲用水中的總大腸菌群主要是指大腸桿菌、大腸菌群和糞大腸菌群三大類型細(xì)菌共同組成的大腸菌群。

二、意義

1. 總大腸菌群主要來自人和溫血動物糞便，還可能來自植物和土壤。
2. 由于其數(shù)量大，在體外存活時間與腸道致病菌相似，且檢驗方法比較簡便，故被作為檢驗?zāi)c道致病菌的指示菌。
3. 水中大腸菌群數(shù)的多少，表明水體被糞便污染的程度，并間接地表明有腸道傳染病菌存在的可能性，但它不是專一的指示菌。
4. 如果在水樣中檢出總大腸菌群，則應(yīng)再檢驗大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群以證明水體是否已經(jīng)受到糞便污染；如果水樣中沒有檢出總大腸菌群，就不必再檢驗大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群。

三、測定方法 —— 多管發(fā)酵法

1. 原理：經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，經(jīng)證實實驗和革蘭氏染色檢測水中總大腸菌群的方法。

2. 培養(yǎng)液與培養(yǎng)基

2.1 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液
成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；乳糖5g；氯化鈉5g；溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L）1mL；純水1000mL（二倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液純水500mL）。
制法：將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于純水中，調(diào)整pH為7.2~7.4，再加入1mL溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻。分裝于裝有小倒管的試管中，經(jīng)115℃高壓蒸汽滅菌20min后，于0~4℃冷藏避光保存。

2.2 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基
成分：蛋白胨10g；乳糖10g；磷酸氫二鉀2g；瓊脂20~30g；純水1000mL；伊紅水溶液（20g/L）20mL；美藍(lán)水溶液（5g/L）13mL。
制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于純水中，校正pH為7.2，加入乳糖，混勻后分裝，經(jīng)115℃高壓蒸汽滅菌20min。臨用時加熱融化瓊脂，冷至50~55℃，加入伊紅和美藍(lán)水溶液，混勻，傾注平皿。

3. 實驗步驟

乳糖發(fā)酵試驗：
① 用無菌吸管或移液器吸取 10 mL水樣接種到10 mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1 mL水樣接種到10 mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1 mL水樣注入到9 mL無菌生理鹽水中，混勻后取1 mL(即0.1 mL水樣）注入到10 mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管；
② 對已處理過的出廠自來水，需經(jīng)常檢驗或每天檢驗一次的，可直接接種5份 10mL水樣接種10mL雙料培養(yǎng)基，每份接種10 mL水樣。
③ 檢驗水源水時，如污染較嚴(yán)重，應(yīng)加大稀釋度，可接種（1mL - 0.1mL - 0.01mL），甚至（0.1mL - 0.01mL - 0.001mL），每個稀釋度接種5管單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，每個水樣共接種15管。接種1 mL以下水樣時，應(yīng)作10倍遞增稀釋后，取1 mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL無菌吸管。

④ 將接種管置于36 ℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h±2 h，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)氣產(chǎn)酸，則可報告為總大腸菌群未檢出，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列步驟進(jìn)行。

分離培養(yǎng)：挑取符合下列特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢
—— 深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；
—— 紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；
—— 淡紫紅色、中心較深的菌落。

筆記：非典型菌落用不用革蘭氏染色，挑幾個菌落？標(biāo)準(zhǔn)里沒有提到，這樣會不會造成漏檢？（個人覺得可疑菌落也要挑取驗證的，GB8538里規(guī)定挑取10個典型菌落做驗證，可以做參考）

證實試驗：經(jīng)上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置36 ℃±l℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h±2 h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在。

4. 實驗數(shù)據(jù)處理

結(jié)果報告：根據(jù)證實為總大腸菌群陽性的管數(shù)，查MNP表（根據(jù)GB/T5750.12所附檢索表），報告每100mL水樣中的總大腸菌群MNP值。稀釋樣品查表后所得結(jié)果應(yīng)乘稀釋倍數(shù)。如所有乳糖發(fā)酵管均為陰性時，可報告總大腸菌群未檢出（報告與總則不一致，50mL水樣報告100mL水樣未檢出不準(zhǔn)確）。

5. 指標(biāo)限值（總大腸菌群：不應(yīng)檢出MPN/100mL或CFU/100mL。）

四、其他

1. 如何殺滅飲用水中的總大腸菌群？

可通過化學(xué)消毒和煮沸殺滅飲用水中的總大腸菌群，常用的化學(xué)消毒劑是含氯制劑和二氧化氯，在日常生活中，煮沸是方便快捷的消毒方式，總大腸菌群在我省農(nóng)村地區(qū)的飲用水中較為常見，因此提倡喝開水以降低和減少介水傳染病的發(fā)生和流行。

2. 相關(guān)“大腸”菌

跟“大腸”有關(guān)的微生物學(xué)或衛(wèi)生學(xué)名詞有：總大腸菌群、大腸菌群、耐熱大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌、大腸桿菌、致病性大腸桿菌等等。

在上述名詞中，除了“大腸桿菌”和“大腸埃希氏菌”是細(xì)菌學(xué)名詞以外，其余幾個都是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而是指具有某些特性的一組細(xì)菌。

總大腸菌群=大腸菌群；耐熱大腸菌群=糞大腸菌群（也有科學(xué)家認(rèn)為耐熱大腸菌群的范圍大于糞大腸菌群）；大腸埃希氏菌=大腸桿菌。

按范圍大小排序：總大腸菌群（大腸菌群）>糞大腸菌群&耐熱大腸菌群>大腸桿菌（大腸埃希氏菌）>致病菌。

大腸桿菌是人和溫血動物腸道內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時，可引起感染，且感染可能是致命的，尤其對老人和小孩！這些侵入人體部位能導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等癥狀的，則稱為致病性大腸桿菌。

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