3月12日，根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》規(guī)定，經(jīng)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)審評委員會審查通過，現(xiàn)發(fā)布《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2024）等47項(xiàng)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)和6項(xiàng)修改單。

主要包括：微生物檢驗(yàn)方法16項(xiàng)：

GB4789.40-2024《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾檢驗(yàn)》為上述標(biāo)準(zhǔn)之一。標(biāo)準(zhǔn)于2024年2月8日發(fā)布，將于2024年8月8日正式實(shí)施。

本文通過對比克羅諾桿菌檢驗(yàn)2024版與2016版標(biāo)準(zhǔn)，使讀者更好地了解2024版修訂的變更，以便更好地掌握克羅諾檢驗(yàn)的發(fā)展方向。

一、簡要說明

本標(biāo)準(zhǔn)與GB4789.40-2016相比主要變化如下：
—— 修改了標(biāo)準(zhǔn)名稱，刪除了阪崎腸桿菌，修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌檢驗(yàn)”。
—— 標(biāo)準(zhǔn)適用范圍增加了嬰幼兒輔助食品;
—— 增加了PCR鑒定方法作為選做內(nèi)容;
—— 刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產(chǎn)黃色素和苦杏仁苷項(xiàng)目;
—— 修改了培養(yǎng)基和試劑pH調(diào)節(jié)方法;
—— 修改了預(yù)熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間;
—— 修改了生化反應(yīng)的培養(yǎng)溫度及氨基酸培養(yǎng)基的制備。

二、變化詳情

1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中克羅諾桿菌(Cronobacterspp)的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗(yàn)。

?無變化
增加嬰幼兒輔助食品

2.設(shè)備和材料

?無變化
1. 刪除25度恒溫培養(yǎng)箱；恒溫水浴溫度范圍調(diào)整，由原來的44℃±0.5℃調(diào)整為41.5℃±1℃；
2. 增加0.01感量的天平；無菌錐形瓶修改為無菌容器；
3. 增加PCR檢測方法的所用到的PCR儀、離心機(jī)、電泳儀、反應(yīng)管、離心管、接種環(huán)等設(shè)備和材料。

3.培養(yǎng)基和試劑

?變化
1. 阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基變更為“克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基”與標(biāo)準(zhǔn)名稱對應(yīng)；
2. 增加PCR檢測方法的培養(yǎng)基和試劑

4.檢驗(yàn)流程

?變化
1. ST-Vm增菌液培養(yǎng)溫度變更為“41.5℃±1℃”；
2. 修改了預(yù)熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間
3. 增加PCR鑒定（選做），可節(jié)省檢測時間

5.操作步驟

5.1 前增菌和選擇性增菌

取檢樣 100g(mL)置于無菌容器中,加入900mL已預(yù)熱至 41℃±1℃的 BPW,用手緩緩地?fù)u動至檢樣充分溶解后,36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。輕輕搖動混勻培養(yǎng)過的前增菌液,移取1mL轉(zhuǎn)入10mLmLST-Vm肉湯中,41.5℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。

?變化
1. 無菌錐形瓶改為“無菌容器”；
2. 為避免溫度較高損傷細(xì)菌，前增菌BPW的預(yù)熱溫度由44℃修改為41 ℃。
3. 44℃的選擇性增菌溫度可能抑制部分損傷的克羅諾桿菌生長，容易導(dǎo)致污染樣品被漏檢。ISO22964-2017標(biāo)準(zhǔn)已對選擇性增菌溫度由 44 ℃±0.5 ℃修改為41.5 ℃±1 ℃。且在制定標(biāo)準(zhǔn)過程中的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也顯示，mLST-Vm肉湯經(jīng)41.5 ℃培養(yǎng)后檢測結(jié)果優(yōu)于44 ℃。因此，GB4789.40新版標(biāo)準(zhǔn)中選擇性增菌溫度修改為41.5 ℃±1 ℃。

5.2 分離

5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物,使用10μL接種環(huán)各取1環(huán)增菌培養(yǎng)物,分別劃線接種于2個克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板,36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,或按培養(yǎng)基要求條件培養(yǎng)。

5.2.2 可疑菌落按顯色培養(yǎng)基要求進(jìn)行判定,每個平板挑取至少 5個可疑菌落(不足5個時挑取全部可疑菌落) ,分別劃線接種于TSA平板,36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。

?變化
1. 分離用的接種環(huán)指出其為10μL的，更明確；
2. 顯色培養(yǎng)基的名稱前后對應(yīng)起來，刪除了“顯色培養(yǎng)基須符合GB4789.28的要求”，個人覺得這是個漏點(diǎn)。
3. 修改了TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間，由原來的25℃±1℃，培養(yǎng)48h±4h修改為“36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h”。

3.增加PCR鑒定方法：隨著微生物檢驗(yàn)對快速方法的檢測需求， GB標(biāo)準(zhǔn)中引入PCR法，即可節(jié)省檢測時間，減少工作量，又可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)對可疑菌落高通量的篩選。

5.4 確證試驗(yàn)

選做5.3時,自PCR結(jié)果陽性的TSA平板上挑取菌落進(jìn)行生化鑒定, PCR結(jié)果陰性的TSA平板不再進(jìn)行生化鑒定。

未選做 5.3時 ,直接將 5.2.2的可疑菌落接種TSA平板后進(jìn)行生化鑒定。

可以首先鑒定克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板上最具特征性的菌落接種的TSA平板上的菌落。如果是陽性,則不需要測試其他TSA平板上的菌落。如果是陰性,則選取其他TSA平板上的菌落進(jìn)行鑒定,直到全部為陰性或發(fā)現(xiàn)陽性菌落為止。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,對TSA平板上的菌落進(jìn)行鑒定時,應(yīng)使用新鮮的傳代菌落。克羅諾桿菌的主要生化特征見表3。 

上述鑒定也可選擇商生化特征見表3。上述鑒定也可選擇商品化生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行 。

?變化
1. 步驟名稱由鑒定修改為“確證試驗(yàn)”；
2. 刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產(chǎn)黃色素項(xiàng)目，因?yàn)樵谖墨I(xiàn)報道和實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)部分克羅諾桿菌不產(chǎn)黃色素，因此在新版標(biāo)準(zhǔn)中刪除了該步驟及生化鑒定中產(chǎn)黃色素項(xiàng)目的操作；
3. 刪除苦杏仁苷生化反應(yīng)；
4. 強(qiáng)調(diào)做生化實(shí)驗(yàn)的菌落一定要新鮮培養(yǎng)物，如果為陰性，需要繼續(xù)則選取其他TSA平板上的菌落進(jìn)行鑒定,直到全部為陰性或發(fā)現(xiàn)陽性菌落為止。

6 結(jié)果與報告

根據(jù)菌落特征、確證試驗(yàn)(生化鑒定)和/或PCR鑒定結(jié)果,報告 100g(mL)樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。

?變化
1. 修改了文字描述；

第二法 克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)

7 操作步驟

7.1 樣品的稀釋

取檢樣100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份,分別置無菌容器中,分別加入900mL、90mL、9mL已預(yù)熱至41℃±1℃的BPW,用手緩緩地?fù)u動至檢樣充分溶解,制成1:10樣品勻液,36 ℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。輕輕搖動混勻培養(yǎng)過的前增菌液,分別移入1mL轉(zhuǎn)入10mL mLST-Vm肉湯,41.5℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。

?變化
1. 修改了檢測方法的名稱；
2. 同第一法一樣修改前增菌、增菌的培養(yǎng)溫度；
3. 修改可了樣品處理的描述分固體和半固體、液體放在一起更簡潔。

7.2 分離、鑒定

同5.2、5.3和5.4。

8 結(jié)果與報告

綜合菌落特征、確證試驗(yàn)(生化鑒定)或 PCR鑒定結(jié)果,根據(jù)檢出克羅諾桿菌的陽性管數(shù),查MPN檢索表,報告100g(mL)樣品中克羅諾桿菌的MPN值(見附錄C中表 C.1) 。

?附錄變化
1. 修改了培養(yǎng)基和試劑pH值調(diào)節(jié)方法，要求pH值滅菌后測定；
2. 修改了相應(yīng)的培養(yǎng)基名稱及增加PCR檢測用的試劑配制方法。
3. 修改了氨基酸培養(yǎng)基的制備。

來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“食品微生物檢測”公眾號；內(nèi)容版權(quán)歸原作者所有。
提醒：文章、視頻、圖片等所有內(nèi)容，僅用于學(xué)習(xí)交流，若有侵權(quán)內(nèi)容及其他涉法內(nèi)容，請及時聯(lián)系刪除或修改，特此聲明！