CRISPR/Cas13a與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合：諾如病毒快速檢測(cè)的新突破
發(fā)布時(shí)間：2024-08-30 瀏覽次數(shù)：564
在微生物學(xué)領(lǐng)域，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)病原體對(duì)于疾病控制和公共衛(wèi)生至關(guān)重要。最近，一項(xiàng)由Li J H, Jing D, Wang Y等研究人員發(fā)表在《Frontiers in Microbiology》雜志上的研究，提出了一種結(jié)合CRISPR/Cas13a和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的快速諾如病毒（Norovirus，NoV）檢測(cè)方法。
方法創(chuàng)新：CRISPR/Cas13a與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)合
NoV是全球范圍內(nèi)引起急性胃腸炎的主要原因之一，其中GII.4和GII.17型是最常見的毒株。傳統(tǒng)檢測(cè)方法如RT-PCR雖然準(zhǔn)確，但耗時(shí)長(zhǎng)且成本高，限制了在資源有限地區(qū)的廣泛應(yīng)用。Li J H等人的研究提出了一種新的解決方案，通過(guò)將CRISPR/Cas13a基因編輯工具與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合，開發(fā)出一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的NoV檢測(cè)方法。
CRISPR/Cas13a系統(tǒng)以其高效特異性識(shí)別和切割RNA的能力而聞名，而等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)則能夠在恒定溫度下快速?gòu)?fù)制DNA，無(wú)需昂貴的熱循環(huán)設(shè)備。將這兩種技術(shù)結(jié)合，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種能夠特異性識(shí)別NoV GII.4和GII.17型RNA序列的CRISPR/Cas13a系統(tǒng)，這項(xiàng)研究的核心在于將CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的特異性與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的快速性相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)NoV的高效檢測(cè)。CRISPR/Cas13a系統(tǒng)能夠精確識(shí)別并切割特定的RNA序列，而等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)則能在恒定溫度下快速擴(kuò)增目標(biāo)核酸，無(wú)需傳統(tǒng)的熱循環(huán)過(guò)程。通過(guò)這種結(jié)合，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了能在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)NoV的檢測(cè)方法，顯著提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。
圖1 RAA/CRISPR-Cas13a用于GII4/GII17 NoVs檢測(cè)的工作流程簡(jiǎn)而言之，從臨床糞便樣本中提取病毒RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)基于重組酶的等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增。將CRISPR/Cas13a試劑離心后與RAA產(chǎn)物混合，引入CRISPR/Cas13a對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的切割和報(bào)告DNA的反式切割。最后，結(jié)果由熒光探測(cè)器測(cè)量或直接由肉眼在藍(lán)色透光器下讀取。
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與應(yīng)用前景
該方法在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)NoV樣本進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示靈敏度為97.96%，特異性為100.0%。在71份臨床糞便樣本中，檢測(cè)下限(LOD)為2.5×100 copies/reaction，符合率為96.75%，具有高度的特異性和敏感性，能夠有效區(qū)分不同的NoV基因型，并且在實(shí)際樣本中也表現(xiàn)出了良好的檢測(cè)效果。此外，該技術(shù)的便攜性和快速性使其非常適合用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，尤其是在資源有限的環(huán)境中，如偏遠(yuǎn)地區(qū)或疫情爆發(fā)初期的快速響應(yīng)。
結(jié)論與展望
這項(xiàng)研究為NoV的快速檢測(cè)提供了一種新的解決方案，不僅提升了檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，還為公共衛(wèi)生領(lǐng)域提供了有力的工具。未來(lái)，隨著技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和成本的降低，這種基于CRISPR/Cas13a與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法有望在更廣泛的范圍內(nèi)得到應(yīng)用，為全球疾病防控和公共衛(wèi)生安全作出更大的貢獻(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：Li J H, Jing D, Wang Y, et al. Establishment and application of a rapid assay for GII. 4/GII. 17 NoV detection based on the combination of CRISPR/Cas13a and isothermal amplification[J]. Frontiers in Microbiology, 2024, 15: 1334387.
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程
