產(chǎn)品名稱：蠟樣芽孢桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）
英文名稱：Rapid Detection Kit for Bacilluscereus (Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 規(guī)格 |
|---|---|
| FZ023BF2 | 48 測(cè)試/盒 |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本試劑盒僅適用于食品中蠟樣芽孢桿菌的定性檢測(cè)。
檢測(cè)原理：基于 Real Time PCR 技術(shù)，利用針對(duì)于蠟樣芽孢桿菌 16s rRNA、gyrB 基因設(shè)計(jì)特異性引物、熒光探針以及其他反應(yīng)所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被 Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號(hào)，此時(shí)熒光定量PCR儀可識(shí)別該熒光信號(hào)，同時(shí)根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定蠟樣芽孢桿菌是否檢出。
16s rRNA、gyrB 基因分別對(duì)應(yīng)熒光報(bào)告基團(tuán) VIC、FAM。
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）產(chǎn)品組分：
儲(chǔ)存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲(chǔ)存，有效期為 12 個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
靈敏度：最低檢驗(yàn)限達(dá)到 100 CFU/Test。
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測(cè) VIC、FAM 標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）使用指南：
1，樣品前處理：
1) 樣品增菌液模板 DNA 的制備：
a) 參照 GB《4789.14-2014 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》處理食品樣品，使用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯進(jìn)行增菌，增菌時(shí)間不低于 24 h。
b) 取以上增菌液 1 mL 到 1.5 mL 規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min 離心 5 min，完全去除上清；
c) 加入 30 μL 裂解液充分懸浮管底沉淀，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min。
d) 12000 r/min 離心 15 min，上清即為待測(cè)樣品 DNA，靜置冰上，長(zhǎng)時(shí)間不用應(yīng)再次離心。
2) 可疑菌落模板 DNA 的制備：挑取 MYP 瓊脂平板上可疑菌落，充分懸浮于預(yù)先加有 30 μL 裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟 c)、d)操作。
以上 2 個(gè) DNA 純化使用商品化的試劑盒提取 DNA 效果更佳。
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取 n 個(gè) PCR 反應(yīng)管（n=1 管陰性對(duì)照+待檢測(cè)樣品數(shù)+1 管陽性對(duì)照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入20 μL預(yù)混液，待用。
2) 向上述 n 個(gè)反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、待測(cè)樣品 DNA、陽性對(duì)照各 5 μL，總反應(yīng)體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，取 VIC、FAM 檢測(cè)通道，在反應(yīng)階段 2 中 60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，具體程序如下：
| 反應(yīng)階段 | 溫度 | 時(shí)間 | 信號(hào)收集 | 循環(huán)數(shù) |
| 1 | 95°C | 30 sec | 1 | |
| 2 | 95°C | 5 sec | } 40 | |
| 60°C | 40 sec | ? |
注：在反應(yīng)階段 2 中 60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，對(duì)于多通道熒光 PCR 儀，取熒光素“VIC”、“FAM”為信號(hào)采集通道，淬滅基團(tuán)選擇“None”，染料校正選擇“None”。
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動(dòng)設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測(cè)結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對(duì)照未出現(xiàn)明顯的 S 型擴(kuò)增曲線或Ct 值＞35，陽性對(duì)照出現(xiàn) S 型擴(kuò)增曲線且其 Ct 值＜30。若陰陽性對(duì)照不同時(shí)滿足上述條件，則本次檢測(cè)結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測(cè)或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
蠟樣芽孢桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）使用注意事項(xiàng)：
1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件和過程控制應(yīng)參照 GB/T 27403《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)》規(guī)定執(zhí)行。
2、使用本試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書全文，檢測(cè)過程中建議穿潔凈工作服，戴一次性手套，使用的移液槍頭需提前滅菌。
3、試劑盒中試劑使用前需充分融化、混勻，短暫離心后使用，期間需盡量避免產(chǎn)生氣泡，加樣完畢后檢查反應(yīng)管是否蓋緊，避免泄露造成污染。
4、待檢測(cè)樣品基因變異可能會(huì)造成假陰性結(jié)果；待檢測(cè)樣品交叉污染、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染以及試劑污染均會(huì)造成假陽性結(jié)果。
5、不同批號(hào)的產(chǎn)品請(qǐng)勿混合使用，請(qǐng)?jiān)诋a(chǎn)品有效期內(nèi)使用試劑盒，由于操作不當(dāng)引起的誤判，以及由此誤判引發(fā)的其他事項(xiàng)，本公司概不負(fù)責(zé)。
6、檢測(cè)完畢后，根據(jù)相關(guān)規(guī)定正確處理廢棄耗材以及擴(kuò)增產(chǎn)物。
