微生物學(xué)檢測(cè)那些事之菌落總數(shù)
發(fā)布時(shí)間：2024-01-24 瀏覽次數(shù)：2226
菌落總數(shù)又稱(chēng)需氧菌總數(shù)、嗜氧菌總數(shù)，在英文標(biāo)準(zhǔn)中的術(shù)語(yǔ)有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic bacterial count，Colonies number等，是微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一種衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)技術(shù)，亦是嗜溫細(xì)菌和真菌的菌落總計(jì)數(shù)，其通過(guò)一定條件下如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等，每單位（如克、毫升等）檢樣所生長(zhǎng)出來(lái)的微生物，在衛(wèi)生學(xué)上可以表示被污染程度的標(biāo)志。
常見(jiàn)操作方法
菌落計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡(jiǎn)稱(chēng)MPN法），其中平皿法可分為傾注平皿法和涂布平皿法，常見(jiàn)的菌落總數(shù)操作方法見(jiàn)表1。
表1 常見(jiàn)菌落總數(shù)的操作方法匯總
| 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn) | 適用范圍 | 操作方法 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》 | 食品 | 傾注平皿法/菌落總數(shù)測(cè)試片 |
| FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 食品 | 傾注平皿法/螺旋板法 |
| GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》 | 飼料 | 傾注平皿法 |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》 | 游泳池水 | 傾注平皿法 |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 | 飲用水/水源水 | 傾注平皿法/酶底物法 |
| WS 394-2012 《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 | 環(huán)境 | 六級(jí)篩孔撞擊式微生物采樣器 |
| GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 | 一次性衛(wèi)生用品 | 傾注平皿法 |
| 《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 | 化妝品 | 傾注平皿法 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 化妝品 | 平皿法/膜過(guò)濾法 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | 藥品 | 平皿法/薄膜過(guò)濾法/MPN法 |
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | ||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | ||
| ChP1105 2020版《非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
根據(jù)上表的適用范圍和操作方法可得出，平皿法是使用范圍最廣。
根據(jù)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)適用范圍和樣品特性：
A. 平皿法因可操作性性強(qiáng)，會(huì)更多用于污染度高的被檢樣品；
B. 薄膜過(guò)濾法適用于測(cè)試量需求大且污染度一般的液體樣品；
C. MPN法可用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差時(shí)，包括對(duì)于某些微生物污染度很小的樣品。
故在日常測(cè)試中，可根據(jù)樣品的污染度情況去選擇更合適的菌落總數(shù)測(cè)試操作方法。
樣品的取樣量與稀釋液選擇
樣品的取樣量與其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或測(cè)試方法去選擇，對(duì)于官方標(biāo)準(zhǔn)未明確取樣量的，亦可根據(jù)結(jié)果的代表性加大取樣量。稀釋緩沖液的選擇則是要求樣品在稀釋緩沖液中能夠充分混合，從而保證樣品的均一性，故不同樣品，會(huì)有不同的稀釋液需求。日常工作中，常見(jiàn)的稀釋緩沖液與要求見(jiàn)表2。
表2 常見(jiàn)的稀釋緩沖液信息匯總
| 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn) | 樣品量 | 稀釋液 | 備注 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》 | 25g/mL | 無(wú)菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 | |
| FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 50g/mL | 磷酸鹽緩沖液/無(wú)菌水 | |
| GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》 | 25g/10g | 0.85%生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 | |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》 | 原液 | 無(wú)菌生理鹽水 | |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 | 原液 | 無(wú)菌生理鹽水 | |
| WS 394-2012 《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 | 28.3L/min，（5-15）min | 不適用 | |
| GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 | 10±1g | 無(wú)菌生理鹽水（200mL） | 不進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?平行 |
| 《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 | 10g/mL | 無(wú)菌生理鹽水 | 無(wú)法充分溶解稀釋液中的樣品可加吐溫80和/或石蠟 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 1:10（樣品：加稀釋液后） | 無(wú)菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等 | 最終的取樣量與稀釋液，需通過(guò)樣品方法學(xué)適用性驗(yàn)證方能使用。 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | |||
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | |||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | |||
| ChP1105 2020版《非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
常見(jiàn)培養(yǎng)條件
菌落總數(shù)的培養(yǎng)條件會(huì)因不同的樣品類(lèi)型或制定機(jī)構(gòu)而有所差異，其差異包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的選擇。菌落總數(shù)常見(jiàn)的培養(yǎng)條件見(jiàn)表3。
表3 菌落總數(shù)的常見(jiàn)培養(yǎng)條件匯總
| 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn) | 培養(yǎng)基 | 培養(yǎng)溫度 | 培養(yǎng)時(shí)間 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》 | 平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） | 36±1℃（水產(chǎn)品30±1℃） | 48±2h（水產(chǎn)品72±3h） |
| FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 35±1℃（牛奶32±1℃） | 48±2h | |
| GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》 | 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA） | 30±1℃ | 72±3h |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》 | 36±1℃ | 48h | |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 | 36±1℃ | 48±2h | |
| WS 394-2012 《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 | 35~37℃ | 48h | |
| GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 | 35±2℃ | 48h后 | |
| 《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 | 卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂 （LTNA） | 36±1℃ | 48±2h |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA） | 32.5±2.5℃ | 72±6h |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | 3~5天 | ||
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | |||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | |||
| ChP1105 2020版《非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
結(jié)果觀察與報(bào)告
菌落總數(shù)在進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU/cfu，Colony Forming Units）進(jìn)行報(bào)告。在計(jì)數(shù)時(shí)，首先需明確計(jì)數(shù)范圍是否符合要求，從而保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，不同的測(cè)試方法在首選計(jì)數(shù)范圍會(huì)有一定差異，以及顯色劑在觀察中的應(yīng)用也有一定的要求。詳情見(jiàn)表4。
表4 結(jié)果觀察與報(bào)告的一般要求
| 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn) | 培養(yǎng)基中是否可加顯色劑1 | 首選計(jì)數(shù)范圍 | 最終結(jié)果報(bào)告 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》 | 是 | 30~300cfu | 100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2，采用“四舍五入”。 |
| FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 否 | 25~250cfu | ＜25cfu則報(bào)告＜25或?qū)嶋H值，＞250cfu則報(bào)告＞250或TNTC2。 |
| GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》 | 否 | 30~300cfu | 100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》 | 否 | 30~300cfu | 100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 | 否 | 30~300cfu | 100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| WS 394-2012 《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 | 否 | 無(wú) | 報(bào)告cfu/m3 |
| GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 | 否 | 無(wú) | 全部無(wú)生長(zhǎng)報(bào)＜4cfu/g（mL），若生長(zhǎng)，報(bào)100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字。 |
| 《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 | 是 | 30~300cfu | 100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 否 | 平皿法：30~300cfu；薄膜過(guò)濾法：15~150cfu。 | 100cfu以?xún)?nèi)報(bào)整數(shù)，超過(guò)100cfu兩位有效數(shù)字。 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | 否 | 平皿法：不超過(guò)250cfu；薄膜過(guò)濾法：記錄結(jié)果。 | 取兩位有效數(shù)字報(bào)告 |
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | |||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | |||
| ChP1105 2020版《非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 | 否 | 平皿法：不超過(guò)300cfu；薄膜過(guò)濾法：不超過(guò)100cfu | 取兩位有效數(shù)字報(bào)告 |
| 注： 1. 顯色劑一般為T(mén)TC，TTC全稱(chēng)為0.5%氯化三苯四氮唑。加此顯示劑后，多數(shù)菌落顯示紅色。 2. TNTC全稱(chēng)為多不可數(shù)，即Too Number To Count。 | |||
菌落總數(shù)的測(cè)定，不同樣品有不同的特性，故在進(jìn)行此方面衛(wèi)生學(xué)測(cè)試時(shí)，結(jié)合行業(yè)需求，以及樣品的生產(chǎn)工藝、消費(fèi)對(duì)象、使用方式等需求，選擇合適的測(cè)試操作流程，同時(shí)保證在報(bào)告結(jié)果時(shí)，亦需根據(jù)市場(chǎng)所選用的方法進(jìn)行報(bào)告結(jié)果。
綜合以上，衛(wèi)生學(xué)的菌落測(cè)試在實(shí)驗(yàn)操作中雖然有差異，但總體的差異性不大，比如培養(yǎng)基都是非選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度基本在35℃左右，培養(yǎng)時(shí)間則溫度越高，時(shí)間則可減少。故保證菌落總數(shù)測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性時(shí)，根據(jù)實(shí)際需求，通過(guò)調(diào)節(jié)測(cè)試方法的取樣、稀釋液、培養(yǎng)條件等來(lái)建立更符合本實(shí)驗(yàn)室的菌落總數(shù)測(cè)試方法。
參考文獻(xiàn)
1、GB4789.2-2022 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》
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3、GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》
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12、EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
13、《無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》通則1105 中國(guó)藥典 2020版
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