實驗干貨 | 原代細胞分離培養(yǎng)（小鼠結腸細胞為例）
發(fā)布時間：2024-02-22 瀏覽次數：2460
01 簡介
原代細胞分離培養(yǎng)是一項實驗技術，它涉及從生物體中提取組織或細胞，并將它們轉移到體外環(huán)境中進行培養(yǎng)。這些來源包括各種組織器官、外周血和胚胎等。在培養(yǎng)過程中，原代細胞的生長速度相對較慢，通常在培養(yǎng)的前10代內停止生長。因此，通常將培養(yǎng)的細胞歸類為原代細胞培養(yǎng)，這些細胞包括第1到第10代的細胞。
原代細胞保持了體內原始細胞的生物學特性，最接近于體內的生長特性。因此，它們?yōu)檠芯可矬w細胞的生長、代謝和繁殖提供了有力的工具。此外，原代細胞培養(yǎng)還為精準醫(yī)療的腫瘤診治模式和個體化精準用藥提供了支持。
常見的原代細胞類型包括上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、黑色素細胞、神經元、星形膠質細胞、肝細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、毛細胞、血細胞和干細胞。
02 實驗原理
在原代細胞分離培養(yǎng)中，首先從動物體內取出各種組織，然后采用不同的方法，如酶消化（通常使用胰蛋白酶/膠原酶）、螯合劑（通常是EDTA）或機械分散，將組織分散成單個細胞。這些單細胞被放置在適當的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以在離體環(huán)境中存活、生長和繁殖。這個過程稱為原代培養(yǎng)，主要包括取材、分離和培養(yǎng)三個步驟。
以小鼠結腸細胞為例，為了提高目標細胞的純度，原代提取的細胞通常與其他細胞混合。通過采用生物酶梯度消化和差速貼壁等方法，可以獲得纖維組織和上皮組織的高純度目標細胞。具體地，使用膠原酶 I 和分散酶 II 消化結腸組織可分散細胞間質，而差異消化和差速貼壁方法則能有效去除成纖維細胞，最終獲得高度純凈的結腸上皮細胞。
03 材料與儀器
含有雙抗的DMEM培養(yǎng)基、5 g/L胰蛋白酶、Buffer溶液（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10mM HEPES）、消化液（DMEM培養(yǎng)基溶解膠原酶I濃度為 0.1%，分散酶II濃度為 0.3%）、無菌剪刀、無菌鑷子、100 μm 細胞過濾器、細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板。
04 實驗步驟
1. 通過使C57BL/6小鼠頸椎脫臼死亡，然后用適量的酒精噴灑和Buffer滴加的方式，快速分離結腸。
2. 沿著腸系膜進行剪開，利用DMEM培養(yǎng)基清洗結腸，以去除其中的腸腔內容物。
3. 使用無菌剪刀將結腸組織剪成約1mm3大小的碎片。
4. 使用10 mL 0.1%膠原酶I和3%分散酶II對組織進行消化，在37℃的搖床上消化25分鐘。
5. 進行吹打混勻，并通過100μm細胞過濾器過濾，以收集上清液。
6. 采用相差消化法和差速貼壁法去除成纖維細胞。
7. 加入1 mL培養(yǎng)基，將細胞懸浮后接種于含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8. 當細胞生長至培養(yǎng)瓶的80-90%時，使用5 g/L胰酶消化液進行消化，然后將其接種于細胞培養(yǎng)板中。
05 「原代培養(yǎng)」注意事項與常見問題
1.注意事項
原代細胞培養(yǎng)具有較高的成本，并對培養(yǎng)條件有嚴格要求。因此，在培養(yǎng)過程中需要特別注意保持無菌環(huán)境，并盡可能去除目標細胞以外的其他細胞。
1.在實驗開始前，必須對所有器械進行消毒處理，并進行高壓滅菌，液體則需要進行無菌過濾處理。
2.酶消化液必須立即現用現配，以確保其活性。
3.在實驗過程中，需要充分消化組織以確保檢測到足夠數量的細胞。
4.同時，也要盡可能充分去除成纖維細胞。
5.在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，必須保持全程無菌操作，以確保培養(yǎng)環(huán)境的純凈性。
3.常見問題
Q: 保存血清最好的方法是什么？
A: 建議將血清存放在 -5℃ 至 -20℃的溫度范圍內。如果存放在4℃，請不要超過一個月。如果無法一次使用完整瓶血清，建議將血清經過無菌分裝后存放在適當的滅菌容器中，然后再放回冷凍。
Q: 如何解凍血清以保持其最佳培養(yǎng)狀態(tài)？
A: 建議將血清從冷凍箱中取出后，首先放置在2～8℃的冰箱中使其融化，然后在室溫下使其完全融化。但務必要注意，在融解過程中必須規(guī)律地搖晃以確保均勻。
Q: 血清解凍后發(fā)現有絮狀沉淀物出現，應該如何處理？
A: 血清中出現沉淀物有很多原因，但最常見的是由于血清中脂蛋白的變性所致。此外，血清解凍后血纖維蛋白的存在也可能導致沉淀物的生成。
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