產(chǎn)品名稱：細菌基因組DNA純化試劑盒（硅膠膜柱法）
英文名稱：Bacterial DNA purification kit（Silica membrane）
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品類型 | 規(guī)格 |
|---|---|---|
| TQ001D0 | 分子試劑 | 50 份/盒 |
產(chǎn)品簡介：用于細菌基因組DNA的小量提取，其原理是利用細胞裂解釋放基因組DNA；隨后利用蛋白酶K降解膜蛋白和纏繞DNA的核蛋白，使DNA充分游離；硅膠膜離心過濾可逆吸附基因組DNA；洗除蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)后，用洗脫液洗脫獲得高純度基因組DNA。使用本試劑盒提取的DNA可用于各種常規(guī)分子實驗操作，包括酶切、PCR、分子雜交等實驗。
儲存條件及有效期：室溫保存，有效期一年，2~8℃條件下儲存更佳。儲存過程中若溶液產(chǎn)生沉淀，使用前將其在室溫放置一段時間或37℃條件下溫育，待充分溶解后搖勻即可使用。
溶菌酶和蛋白酶K溶解后，和RNase一起-20℃存放。
樣本類型：新鮮細菌培養(yǎng)液或菌落懸浮液。
細菌基因組DNA純化試劑盒(硅膠膜柱法)試劑盒組成：
| 序號 | 產(chǎn)品組成 | 規(guī)格 |
| 1 | 懸浮液 | 17.5 mL |
| 2 | 裂解液 | 15 mL |
| 3 | 去蛋白緩沖液 | 24 mL（使用前加16 mL無水乙醇） |
| 4 | 漂洗液 | 15 mL（使用前加60 mL無水乙醇） |
| 5 | 洗脫液 | 10 mL |
| 6 | DNA硅膠膜吸附柱 | 50 套 |
| 7 | 蛋白酶K | 干粉 |
| 8 | 蛋白酶K配置液 | 1 mL |
| 9 | 溶菌酶 | 干粉 |
| 10 | 溶菌酶配置液 | 4 mL |
| 11 | RNase | 220 μL |
| 12 | 使用說明書 | 1份 |
提取得率：1 mL純培養(yǎng)菌液對數(shù)生長期的菌液（107~109 cells）基因組DNA的提取量分別為：革蘭氏陰性菌6~25 μg，革蘭氏陽性菌為6~15 μg；OD260/280=1.7~1.9。
細菌基因組 DNA 純化試劑盒（硅膠膜柱法）使用方法：
● 初次使用前請在去蛋白緩沖液和漂洗液中加入無水乙醇，參見瓶身標簽或使用說明書。
● 將蛋白酶K的粉末倒入蛋白酶K配置液中，渦旋振蕩充分混勻，濃度為20 mg/mL。
● 將溶菌酶干粉倒入溶菌酶配置液瓶中，渦旋振蕩充分混勻，濃度為20 mg/mL。
1，吸取1~2 mL對數(shù)生長期細菌培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中。12,000 r/min離心1 min，盡量吸除上清。
2，中收集的菌體沉淀加入120 μL懸浮液，充分懸浮后加入80 μL溶菌酶和4 μL RNase A 溶液，震蕩混勻后，37℃水浴10~30 min。
● （革蘭氏陰性菌水浴10~15 min，革蘭氏陽性菌水浴20~30 min；若是難提取的葡萄球菌屬細菌可加入1 μL 溶葡酶 （20 mg/mL）一起水浴。溶葡酶需客戶自行購買）
● 對于難裂解的細菌如芽孢桿菌和葡萄球菌等，可把懸浮液用量增加至320 μL，和酶水浴后，加入200 mg左右玻璃珠（0.1~0.2 mm）高速渦旋10 min以進一步裂解細菌。靜置1 min，取200 μL上清液至新的離心管中，再進行下一步。（玻璃珠需客戶自行購買）
3，加入220 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，立即渦旋振蕩混勻，65℃~70℃水浴或金屬浴10~15 min，溶液形成清亮的懸浮液。
● 先加裂解液再加蛋白酶K，避免蛋白酶K活性減弱。
● 裂解液加入后會產(chǎn)生白色沉淀，一般水浴或金屬浴后會消失，不會影響后續(xù)提取。如溶液未變清亮，說明細菌裂解不徹底，可能導致DNA提取量減少或不純。如提取菌體超過1.5 mL，可適當延長溫育時間。
●（ 可選）12,000 r/min離心1 min去除未裂解完全菌體，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。
4，加入220 μL無水乙醇，振蕩混勻，此時可能出現(xiàn)白色絮狀沉淀，簡短離心將內(nèi)壁的液體離心到管底。
5，將所得的溶液和絮狀沉淀全部加入DNA硅膠膜吸附柱上（吸附柱套入收集管中），12,000 r/min離心1 min，倒掉濾液，吸附柱套回收集管。
● 溶液中基因組DNA吸附在硅膠膜上，如發(fā)生堵塞，說明提取的菌體過量，應適當減少菌量或延長離心時間，直到所有的溶液順利離心到收集管中為止。
6，加入500 μL去蛋白緩沖液，12,000 r/min離心1 min，倒掉濾液，吸附柱套回收集管。
? 去蛋白緩沖液初次使用前加入16 mL無水乙醇。
7，加入500 μL漂洗液，12,000 r/min離心1 min，倒掉濾液，吸附柱套回收集管。
? 漂洗液初次使用前加入 60 mL 無水乙醇。
8，再次加入500 μL漂洗液，12,000 r/min離心1 min，倒掉濾液，吸附柱套回收集管，再次12,000 r/min離心1 min，徹底去除吸附柱中殘留的液體，室溫放置2 min，去除殘留的乙醇。
9，將吸附柱套入新的1.5 mL無菌的離心管中，向吸附柱中央處懸空滴加50~100 μL洗脫液，室溫靜置5 min，12,000 r/min離心2 min，離心得到的液體轉(zhuǎn)移到無菌的EP管中，-20℃保存待用。
● 洗脫液可用無菌去離子水替代，但pH值應在8.0~8.5。
● 將洗脫液預熱到60℃使用，可提高基因組DNA得率。
● 為提高基因組DNA提取得率，可將洗脫得到的溶液再次吸出滴加到吸附柱中央，靜置幾分鐘后再次離心收集。
純度及濃度檢測分析：
1、提取得到的細菌基因組DNA片段可用紫外分光光度計測量濃度與純度。
2、DNA在OD260處有明顯的吸收峰，在此條件下，1 OD值的光密度相當于雙鏈DNA濃度為50 μg/mL；單鏈DNA或2.RNA為40 μg/mL；寡核苷酸為20 μg/mL。
3、OD260/280=1.7~1.9，如果A260/280≤1.7或比值過低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)污染，需要純化樣品。若DNA樣品中A260/280≥2.0表明樣品有RNA或DNA降解。
4、洗脫液使用去離子水時候，OD260/280會偏低，但不表示純度低。
細菌基因組DNA純化試劑盒(硅膠膜柱法)使用注意事項：
1、本試劑盒提取使用的器皿、移液器等均應為專用，離心管、槍頭等一次性耗材需進行高壓滅菌。操作人員應穿戴潔凈工作服、口罩、帽子、使用一次性無粉手套。
2、使用新鮮培養(yǎng)的菌液，確保提取的基因組DNA不被降解。
3、加入懸浮液后應充分懸浮菌液，以免影響提取效果。
4、裂解液注意不要直接接觸皮膚，如有接觸請用大量清水沖洗。
5、去蛋白緩沖液和漂洗液使用后蓋緊蓋子，以免乙醇揮發(fā)影響抽提效果。
6、基因組DNA需長期保存，建議使用洗脫液洗脫，分裝保存于-20℃或-80℃。
7、請嚴格按照本說明書操作步驟進行，不同批號的試劑若無特殊說明，請勿混合使用，并保證在有效期內(nèi)使用該試劑盒，因操作不當導致的基因組DNA提取效果不佳，本公司概不負責。
8、妥善處理所有樣本和試劑材料，徹底清潔和消毒操作臺面。
