嬰兒奶粉中乳酸菌活細(xì)胞快速檢測(cè)的進(jìn)步：基于FCM法
發(fā)布時(shí)間：2024-08-26 瀏覽次數(shù)：282
乳酸菌：調(diào)節(jié)人體腸道菌群無形的手
乳酸菌是一類能將糖類發(fā)酵生成乳酸的益生菌，廣泛存在于乳制品、發(fā)酵食品以及人體的消化道和生殖道中。它們?cè)谑称饭I(yè)中常用于發(fā)酵酸奶、奶酪等產(chǎn)品。乳酸菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)消化吸收并增強(qiáng)免疫：如羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌可以治療嬰兒腸痛，因此在醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。乳酸菌檢測(cè)對(duì)于評(píng)估食品安全性、保證產(chǎn)品質(zhì)量以及維護(hù)腸道健康至關(guān)重要。
FCM法：乳酸菌檢測(cè)的主要操盤手
FCM法（Fluorescence Correlation Microscopy，熒光相關(guān)顯微鏡法）是一種基于熒光標(biāo)記的顯微技術(shù)，用于分析分子在溶液中的動(dòng)態(tài)行為。通過檢測(cè)熒光分子的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，F(xiàn)CM法可以提供分子濃度、擴(kuò)散速度、相互作用等信息，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究。由于過去開發(fā)的LAMP，MALDI-TOF-MS法等或多或少都存在一些缺陷——如無法定量、時(shí)間成本高等，并且單獨(dú)的FCM法不具有特異性，因此FCM法聯(lián)用PMA和FISH便被開發(fā)出來。
1+1>2:多種生物技術(shù)的聯(lián)用煥發(fā)的勃勃生機(jī)
對(duì)樣品預(yù)處理后，使用PMA對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，再利用特異性熒光探針（FISH）對(duì)活菌細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記（該熒光探針為RNA探針LAB 158用于乳酸桿菌細(xì)胞的特異性染色）。通過固定步驟使用固定液(PFA)和透化劑改變樣本通透性，進(jìn)而進(jìn)行雜交步驟，最后在流式細(xì)胞儀488nm處進(jìn)行分析，乳桿菌細(xì)胞的定量則通過平板法測(cè)定實(shí)現(xiàn)。
排除艱難險(xiǎn)阻：核心問題的優(yōu)化
使用FISH方法必須越過的大山有一座，那就是采用增強(qiáng)探針的信號(hào)等手段優(yōu)化染色過程提升雜交強(qiáng)度，目前總共有五大類手段來解決這一問題：一是提高探針濃度，此方法中對(duì)樣品采用了消化處理，以消化其中的蛋白質(zhì)和脂肪減少了雜質(zhì)的數(shù)量，并且將乳酸菌細(xì)胞暴露于CHI這種廣譜抗生素中以增加細(xì)胞rRNA含量。二是優(yōu)化雜交條件，通常FISH方法的雜交溫度為37°C到42°C之間，并且可以通過延長(zhǎng)雜交時(shí)間來增強(qiáng)信號(hào)。該方法首先在不同雜交溫度(36、38、40、42、44、46和48°C)下使用最終濃度約為109cells/mL的乳桿菌細(xì)胞懸液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定了雜交溫度為42°C時(shí)，相對(duì)FL強(qiáng)度最高，并輔以CHI。三是使用信號(hào)放大系統(tǒng)，常用的放大技術(shù)為TSA（Tyramide Signal Amplification），它利用辣根過氧化物酶（HRP）催化酚類化合物的聚合反應(yīng)，將多個(gè)熒光分子沉積在探針結(jié)合的部位，從而顯著增強(qiáng)信號(hào)，本方法使用的CHI亦是同理。四是使用更亮的熒光染料，如Alexa Fluor系列染料，比傳統(tǒng)的FITC、TRITC等染料具有更高的熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性。五是減少背景噪聲，通過調(diào)整洗滌液的鹽濃度和溫度去除未結(jié)合的探針和非特異性結(jié)合物或者在雜交前使用封閉劑（如牛血清白蛋白，BSA）處理樣本，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景信號(hào)。在解決完這些核心問題之后，該方法被進(jìn)行了活乳桿菌細(xì)胞定量的驗(yàn)證，并具有較好的特異性。PMA- Serfish -FCM法的TTR總計(jì)近2.5 h，其中預(yù)處理20 min, PMA染色10 min，寡核苷酸探針染色115 min, FCM分析5 min，新方法的TTR比傳統(tǒng)的方法要短得多。
結(jié)論：該項(xiàng)研究提供了一種全新的嬰兒配方奶粉質(zhì)量檢測(cè)思路，通過三種生物技術(shù)的結(jié)合有效增強(qiáng)了奶粉中活乳酸菌細(xì)胞檢測(cè)特異性，提高了準(zhǔn)確性并減少了時(shí)間成本，這一方法為乳酸菌活菌的檢測(cè)手段提供了新的思路和可能性。但它也存在一些不足，如FCM技術(shù)所需的經(jīng)濟(jì)成本較高，手段較為繁瑣。
原文doi：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03742
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~雷曉旭
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