三糖鐵試驗是沙門氏菌初篩的常用生化試驗，但有些檢驗員對其反應(yīng)原理和結(jié)果解釋不甚明了，筆者就此細(xì)細(xì)道來。

一、三糖鐵試驗原理

三糖鐵試驗通過測試細(xì)菌發(fā)酵糖以及產(chǎn)生H₂S的能力，對其進(jìn)行初步鑒定。細(xì)看三糖鐵的配方，其中含有三種糖：乳糖、蔗糖和葡萄糖，而且葡萄糖的含量為0.1%，是乳糖、蔗糖含量的十分之一。事實上，用三糖鐵瓊脂進(jìn)行糖發(fā)酵試驗的巧妙之處，就是在于葡萄糖的含量、葡萄糖/乳糖（蔗糖）的比例，以及與18-24h培養(yǎng)時間的配合。     

三糖鐵試驗中葡萄糖的發(fā)酵有兩種途徑，一是在培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行的有氧代謝。葡萄糖發(fā)酵后的中間產(chǎn)物丙酮酸，在有氧的條件下，通過三羧酸循環(huán)完全分解，產(chǎn)生CO₂、水。
另一種是在三糖鐵底層進(jìn)行的無氧代謝。葡萄糖在厭氧的條件下，通過EMP途徑分解為丙酮酸，丙酮酸再進(jìn)一步分解產(chǎn)生各種穩(wěn)定的終產(chǎn)物：乳酸等有機酸、醛、醇、CO₂、H2。

三糖鐵培養(yǎng)基中所用的酸堿指示劑是酚紅，其在酸性條件下（pH<6）顯黃色，在堿性條件下（pH>8.4）顯紅色。對于不發(fā)酵乳糖、蔗糖的沙門氏菌，培養(yǎng)開始后細(xì)菌先利用低含量的葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，斜面變?yōu)辄S色。在有氧的條件下，丙酮酸繼續(xù)分解為CO₂和水。培養(yǎng)后18-24h，三糖鐵斜面中低含量（0.1%）的葡萄糖已完全分解為CO₂和水，細(xì)菌開始以培養(yǎng)基中的蛋白胨作為營養(yǎng)，分解蛋白胨產(chǎn)氨，培養(yǎng)基斜面中的酚紅指示劑，顯示為紅色的堿性反應(yīng)。

培養(yǎng)后18-24h，在三糖鐵的底層，葡萄糖在厭氧的條件下分解形成有機酸，一些有機酸繼續(xù)分解為CO₂和H₂ ，但在培養(yǎng)基底層中仍有部分有機酸存在，導(dǎo)致酚紅指示劑顯示為黃色的酸性反應(yīng)（見圖1）。

對于發(fā)酵葡萄糖和乳糖的大腸埃希氏菌、雙相亞利桑那菌，以及發(fā)酵葡萄糖和蔗糖的普通變形桿菌。培養(yǎng)后18-24h，三糖鐵斜面中較高含量的乳糖（蔗糖），還沒有完全分解，中間產(chǎn)物丙酮酸仍然存在,此時培養(yǎng)基斜面中的酚紅指示劑，顯示為黃色的酸性反應(yīng)。而在三糖鐵的底層，乳糖（蔗糖）在厭氧的條件下分解形成大量有機酸，培養(yǎng)基底層中的酚紅指示劑，也顯示為黃色的酸性反應(yīng)（見圖2）。

對于乳糖、蔗糖和葡萄糖都不發(fā)酵的糞產(chǎn)堿桿菌，由于不能利用三糖鐵中的糖，細(xì)菌是以培養(yǎng)基中的蛋白胨為營養(yǎng)，分解蛋白胨產(chǎn)氨，導(dǎo)致培養(yǎng)基斜面和底層中的酚紅指示劑，均顯示為紅色的堿性反應(yīng)（見圖3）。在三糖鐵瓊脂上只有出現(xiàn)這種反應(yīng)時，才可確定待測菌為非沙門氏菌。

三糖鐵配方中的硫代硫酸鈉和硫酸亞鐵銨，是檢測H2_S的指示劑。一些細(xì)菌在酸性的條件，將硫代硫酸鈉還原并產(chǎn)生H₂S，H₂S與硫酸亞鐵銨中的鐵離子形成黑色的硫化亞鐵沉淀（見圖4）。

二、三糖鐵試驗操作步驟及要點

1、準(zhǔn)備三糖鐵瓊脂時，斜面的長度與底層的高度最好一致。為了產(chǎn)生良好的厭氧環(huán)境，底層的高度應(yīng)不小于3 cm。

2、待測菌宜來自沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基上可疑菌落，其他來源的未知菌應(yīng)確保是觸酶陽性的革蘭氏陰性菌，另外還應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗，以區(qū)分氧化酶陽性的非發(fā)酵菌。

3、從待測菌菌落的中心部位挑取菌苔，以免混入雜菌。在實際檢測工作中，有時候發(fā)現(xiàn)在沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基上菌落非常典型，但其三糖鐵試驗的結(jié)果卻難以解釋。出現(xiàn)這種情況時，應(yīng)考慮是否存在接種的菌株不純的問題。為避免混入雜菌，也可將選擇性培養(yǎng)基上可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，再挑單個菌落進(jìn)行測試。

4、用接種針進(jìn)行接種，切記不要用接種環(huán)，否則會插裂瓊脂破壞厭氧環(huán)境，并可能導(dǎo)致誤判產(chǎn)氣結(jié)果。

5、通常的接種順序，是先在斜面劃線，再于底層穿刺。筆者覺得最好先穿刺底層，再于斜面劃線，這樣可以防止在培養(yǎng)基底層漏種細(xì)菌。其實只要穿刺并確保斜面及底層都接種了細(xì)菌，斜面的劃線接種已顯得不是辣么鐵別重要了。

6、接種完成后，不要將試管帽旋緊或試管塞塞緊，以免影響斜面氧氣的供應(yīng)和葡萄糖的有氧代謝。

7、將完成接種的三糖鐵瓊脂，置于36℃培養(yǎng)18-24h。

三、三糖鐵試驗結(jié)果觀察

01、糖發(fā)酵的結(jié)果觀察

糖發(fā)酵的結(jié)果是通過培養(yǎng)基的顏色變化來觀察。三糖鐵試驗的培養(yǎng)時間是18-24h，應(yīng)在這個時間范圍內(nèi)觀察的結(jié)果，不能提早也不要延遲。

這是因為，對于只發(fā)酵葡萄糖的細(xì)菌，如果過早觀察結(jié)果（比如培養(yǎng)后12h或更早），此時斜面中少量的葡萄糖尚未分解完全，存在中間產(chǎn)物丙酮酸導(dǎo)致斜面呈現(xiàn)黃色的酸性反應(yīng)，以致錯誤地判斷該菌發(fā)酵乳糖（蔗糖）。如果延遲觀察結(jié)果（比如培養(yǎng)后48h以上），此時底層的葡萄糖也完全分解了，細(xì)菌開始分解蛋白胨產(chǎn)氨，底層和斜面都出現(xiàn)紅色的堿性反應(yīng)，以致錯誤地判斷該菌對三種糖均不發(fā)酵。

很多時候由于H₂S的大量產(chǎn)生，三糖鐵瓊脂底層全部變黑，無法觀察底層糖發(fā)酵的結(jié)果（見圖4）。因此，有檢驗員在培養(yǎng)基底層接種時，不把接種針穿刺至試管底部，而是留出一段底層不接種細(xì)菌，以便于糖發(fā)酵結(jié)果的觀察。其實出現(xiàn)三糖鐵瓊脂底層全部變黑時，可直接判斷為底層產(chǎn)酸。因為有研究表明，在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)H₂S的細(xì)菌，同時也發(fā)酵糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。所以各位親，不要怕黑，還是一針到底吧。

另外小聲講一句，培養(yǎng)時將三糖鐵瓊脂的試管塞旋松，還可以減緩H₂S的過量產(chǎn)生哈。這個小秘訣，一般人我不告訴他！嘿嘿~

需要提醒的是，當(dāng)培養(yǎng)基的斜面和底層都出現(xiàn)紅色堿性反應(yīng)，并確定待測菌為非沙門氏菌時，應(yīng)仔細(xì)檢查穿刺線和斜面的劃線，觀察是否有細(xì)菌生長的跡象，以排除漏種細(xì)菌的情況。

對觀察的結(jié)果應(yīng)及時進(jìn)行記錄，可將培養(yǎng)后的三糖鐵瓊脂置冰箱冷藏不超過四天，但不能用冷藏后的三糖鐵瓊脂，再次進(jìn)行結(jié)果的判讀。

02、產(chǎn)H₂S結(jié)果觀察

當(dāng)三糖鐵瓊脂出現(xiàn)黑色沉淀，黑色沉淀蔓延至整個底層并掩蓋酸性反應(yīng)，甚至斜面上也出現(xiàn)少量黑色沉淀；或者黑色沉淀蔓延底層并沒有掩蓋酸性反應(yīng)；或者在底層的頂部出現(xiàn)一圈黑色環(huán)時，均判斷為產(chǎn)H₂S。

還要說明的是，一些在克氏雙糖鐵瓊脂上產(chǎn)H₂S的菌株，在三糖鐵瓊脂上卻不產(chǎn)H₂S，這可能是蔗糖抑制了還原硫代硫酸鈉的酶。另外，也不是所有H2S陽性的沙門氏菌，在三糖鐵瓊脂上都產(chǎn)H₂S。

03、產(chǎn)氣的結(jié)果觀察

首先需要指出的是，產(chǎn)氣是指產(chǎn)CO₂和H₂，并不是指產(chǎn)H₂S。當(dāng)培養(yǎng)基中出現(xiàn)以下現(xiàn)象之一，可判斷為產(chǎn)氣：培養(yǎng)基內(nèi)有單個或多個氣泡；培養(yǎng)基開裂；培養(yǎng)基從試管底部全部上移，在試管底出現(xiàn)空腔；在試管的一側(cè)，培養(yǎng)基出現(xiàn)缺口或凹陷（見圖2）。

四、實驗結(jié)果記錄

三糖鐵試驗的結(jié)果記錄，宜用規(guī)范的方式，常見的套路是先描述斜面的反應(yīng)，再描述底層的反應(yīng)，中間用斜杠隔開。例如，腸炎沙門氏菌三糖鐵試驗的典型反應(yīng)為，斜面產(chǎn)堿，底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)H₂S。其結(jié)果可按如下方式記錄：

K/?，H2S

注：K代表產(chǎn)堿，A代表產(chǎn)酸，○代表產(chǎn)氣，H2S代表產(chǎn)硫化氫。

主要參考文獻(xiàn)：
1、J F MacFadden. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria[M]. Third Edition. Williams & Wilkins, Baltimore, 2000.
2、Difco & BBL Manual.Manual of Microbiological Culture Media[M].BD Diagnostics,USA, 2009.  

來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于實驗助手app公眾號，作者~阿加西；
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