還原型抗壞血酸能還原染料2.6-二氯酚靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒(méi)有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2.6-二氯酚靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。

  (1)2%草酸溶液：溶解20克草酸結(jié)晶于200毫升水中，然后稀釋至1000ml。

  (2)1%草酸溶液：取上述2%草酸溶液500ml，用水稀釋至1000m1。

  (3)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取20mg抗壞血酸，溶于1%草酸溶液中，移入lOml量瓶中，并用1%草酸溶液稀釋至100毫升，混勻，置冰箱中保存。

  使用時(shí)吸取上述抗壞血酸5ml，置于50毫升容量瓶中，用1%草酸溶液定容之。此標(biāo)準(zhǔn)使用液每毫升含0.02mg維生素C。

  標(biāo)定：吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液5m1于三角燒瓶中，加入6%碘化鉀溶液0.5ml，1%淀粉溶液3滴，再以0.001N碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點(diǎn)為淡藍(lán)色。

  計(jì)算方法

  抗壞血酸濃度(mg/ml)=( V1×0.088)/V2

  V1：滴定時(shí)所耗0.001N碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的量(ml)

  V2：所取抗壞血酸的量(ml)

  0.088：lml 0.0001N碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于抗壞血酸的量(mg/m1)

  (4)2.6-二氯靛酚溶液：稱取碳酸氫鈉52mg，溶于200ml沸水中，然后稱取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氫鈉的溶液中，待冷，置于冰箱中過(guò)夜，次日過(guò)濾置于250ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。此液應(yīng)貯于棕色瓶中并冷藏，每星期至少標(biāo)定1次。

  標(biāo)定方法：取5m1已知濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1%草酸溶液5ml，搖勻，用上述配制的染料溶液滴定至溶液呈粉紅色于15秒不褪色為止

  每毫升染料溶液相當(dāng)于Vc的毫克數(shù)=滴定度(T)=(C×V1)/V2

  公式中：

  C：抗壞血酸(V)的濃度(mg/m1)

  Vl：抗壞血酸的量(m1)

  V2：消耗染料溶液量(m1)

  (5)0.1N碘酸鉀溶液：精確取干燥的碘酸鉀0.100ml。0.3567克用水稀釋至100ml

  (6)0.001N碘酸鉀溶液：吸取0.1N碘酸鉀溶液1ml，用水稀釋至100毫升。此溶液1ml相當(dāng)于抗壞血酸0.088mg

  (7)1%淀粉溶液

  (8)6%碘化鉀溶液

  1、稱取適量(50.0-100.0克)樣品，加等量的2%草酸溶液，倒入組織搗碎機(jī)中搗成勻漿。稱取10.00-30.00克漿狀樣品(使其含有抗壞血酸1-5mg)，置于小燒杯中，用1%草酸溶液將樣品移入100毫升容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻。

  2、將樣液過(guò)濾，棄去最初毫升濾液。若樣液具有顏色，用白陶土(應(yīng)選擇脫色力強(qiáng)但對(duì)抗壞血酸無(wú)損失的白陶土)去色，然后迅速吸取5-lOml濾液，置于50ml三角燒瓶中，用標(biāo)定的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉紅色于15秒內(nèi)不褪色為止。

  計(jì)算方法

  每百克樣品中抗壞血酸毫克數(shù)=(V .T)/W×100

  V：滴定時(shí)所耗去染料溶液的量(ml);

  T：lml染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量(mg)

  W：滴定時(shí)所取的濾液中含樣品量(g).

  (1)所有試劑配制最好用重蒸餾水。

  (2)樣品取樣后，應(yīng)浸泡在已知量2%草酸溶液中使抗壞血酸受損失。以免發(fā)生氧化，使抗壞血酸受損失。

  (3)對(duì)動(dòng)性的樣品可用10%三氯醋酸代替2%草酸溶液提取;對(duì)含有大量Fe的樣品，如儲(chǔ)藏過(guò)久的罐頭食品可用8%醋酸溶液代替草酸溶液提取。

  (4)整個(gè)操作過(guò)程要迅速，防止還原型抗壞血酸被氧化。

  (5)若樣品濾液無(wú)色，可不加色陶土。須加白陶土的，要對(duì)每批新的白陶土測(cè)定回收率。加白陶土脫色過(guò)濾后，樣品要迅速滴定。

  (6)滴定開(kāi)始時(shí)，染料溶液要迅速加入，直至紅色不立即消失而后盡可能一滴一滴地加入，并要不斷振動(dòng)三角燒瓶，直至呈粉紅色于15秒內(nèi)不消失為止。樣品中可能有其他雜質(zhì)也能還原2.6-二氯靛酚，但一般雜質(zhì)還原該染料的速度均較抗壞血酸慢，所以滴定時(shí)以15秒鐘紅色不褪為終點(diǎn)。

  (7)測(cè)定樣品溶液時(shí)必須同時(shí)作一空白對(duì)照，樣品溶液滴定的毫升數(shù)須扣除空白液滴定的毫升數(shù)。

  用酸處理過(guò)的活性炭把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸再繼續(xù)氧化為二酮古樂(lè)糖酸。二酮古樂(lè)糖酸與2.4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的絡(luò)合物。其呈色的強(qiáng)度與二酮古樂(lè)糖酸濃度成正比，可以比色定量。

  (1) 1%草酸溶液

  (2) 2%草酸溶液

  (3)酸處理過(guò)的活性炭：取200克活性炭，加入10%鹽酸1000ml，煮沸后，抽氣過(guò)濾，再用沸水1000ml煮沸，過(guò)濾，重復(fù)用水洗至濾液中無(wú)高價(jià)鐵離子(即用1%硫氰化鉀溶液試驗(yàn)不呈紅色為止)，于100-120℃烘干。

  (4) 2%2.4-二硝基苯肼溶液：取2克2.4-二硝基苯肼溶液溶解于lOOml9N硫酸中

  (5) 9N硫酸溶液：量取濃硫酸250ml，慢慢地倒入750m1水中，加水邊攪拌

  (6) 10%硫酸溶液：稱取5克硫酸，溶解于50ml 50%酒精中

  (7) 85%硫酸溶液：精確稱取20mg抗壞血酸，溶解在1%草酸中，溶液稀釋至lOOml。吸取此液50ml，加入0.1克活性炭，振搖1分鐘，過(guò)濾吸取上述濾液5ml，用1%草酸稀釋到100毫升(此標(biāo)準(zhǔn)使用液每亳升含lOug抗壞血酸)

  (1)樣品的處理和分析：稱取適量樣品加等量的2%草酸溶液于組織搗碎機(jī)中打成勻漿。取勻漿20克用1%草酸稀釋至lOOml，搖勻，過(guò)濾。

  取濾液lOml，加入1%草酸10ml(取濾液的量視抗壞血酸含量而定，一般控制每毫升抗壞血酸的濃度為1-lOug)，加l勺活性炭，搖1分鐘，靜置過(guò)濾。

  各取濾液2毫升于樣品管和樣品空白管中，各管加1滴硫酸溶液。于樣品管中加入2.4-二硝基苯肼0.5ml，樣品管，樣品空白管加蓋，置于37℃保溫箱中保溫3小時(shí)。后取出樣品管放人冰水中，樣品管和樣品空白管置于冰浴中，從滴點(diǎn)管中滴加85%硫酸2ml于各管中，邊滴邊搖試管(為防止溶液溫度升高，溶液中糖炭化而轉(zhuǎn)黑色)。

  將各管于冰浴中取出，在室溫下放置30分鐘后，立即在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm處讀取光密度。根據(jù)測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的含量。

  (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)工作液10、20、30、40、50ml，稀釋至50ml，這些標(biāo)準(zhǔn)液每毫升含有2、4、6、8、lOug抗壞血酸。

  各取2ml，置于各標(biāo)準(zhǔn)管中，加硫酸溶液1滴和2.4-二硝基苯肼溶液0.5ml，置各管于30℃保溫箱中保溫3—4小時(shí)，取出，放在冰浴中，于各管中滴加85%硫酸2.5ml邊滴邊搖試管，然后取出，放置30分鐘，于分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定光密度。根據(jù)測(cè)得的光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  同時(shí)作一試劑空白，于一試劑空白管中加入1%草酸溶液2m1，操作同標(biāo)準(zhǔn)管。

  計(jì)算：每百克食品中含抗壞血酸的毫克數(shù)=C/W×100

  C：相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)溶液的量(mg)

  W：測(cè)定時(shí)所取得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量(g)

  (1) 加入85%硫酸后，將試管從水中取出。溶液的顏色會(huì)繼續(xù)變深所以必須計(jì)算好，加入硫酸后準(zhǔn)于30分鐘內(nèi)比色。

  (2)硫酸可防止抗壞血酸被氧化，且可幫助準(zhǔn)于的形成，最終溶液中硫酸的濃度均需一致，否則影響色度。